Genetic analysis in various razor shell species of family pharidae, with focus on atlantic "Ensis"

[Resumen] En esta tesis se ha realizado un estudio genético de un grupo de bivalvos marinos de la familia Pharidae Adams y Adams, 1858, y principalmente de las navajas del género Ensis Schumacher, 1817. El estudio se desarrolla dentro de las áreas de la genética evolutiva, genética poblacional, citogenética, delimitación de especies y DNA barcoding. Las especies de navaja utilizadas fueron seleccionadas debido al interés comercial que muchas especies de Ensis tienen en varias regiones de Europa y América, incluyéndose también el litoral de Galicia. Además, su distribución a ambos lados del Atlántico y en zonas de la costa pacífica de los Estados Unidos, El Perú y Chile hace que sean de interés en estudios filogeográficos. Por último, los problemas en la identificación de las especies a partir de caracteres morfológicos hicieron de este grupo de organismos un buen candidato para el desarrollo de herramientas moleculares y citogenéticas que complementasen los estudios de morfometría. La metodología utilizada varía en cierto modo a lo largo de cada uno de los capítulos que conforman los resultados de la tesis, aunque puede resumirse como sigue: en el capítulo 4.1.1, el ADN ribosomal 5S y el ADN pequeño nuclear U1, que conforman familias génicas de copia múltiple, fueron estudiados mediante un procedimiento de amplificación por PCR, clonación y secuenciación. Todas estas secuencias obtenidas experimentalmente en el laboratorio fueron posteriormente analizadas mediante numerosas herramientas bioinformáticas. En el capítulo 4.1.2, en el que se estudiaron 97 especies de metazoos, la metodología utilizada fue diferente, ya que se utilizaron bases de datos de proyectos genoma y herramientas bioinformáticas de alta capacidad, algunas de las cuales fueron diseñadas expresamente para este trabajo. En el capítulo 4.2 se realizó un estudio citogenético en el que se utilizaron técnicas de microscopía en campo claro y fluorescente, así como la hibridación de sondas fluorescentes sobre los cromosomas de las navajas, que fueron utilizadas como marcadores cromosómicos. Se realizó también la medición y ordenación de los cromosomas por tamaño e índice centromérico, para elaborar los cariotipos. Por último, en los capítulos 4.3 y 4.4 se utilizaron como marcadores moleculares diferentes regiones de los genomas nuclear y mitocondrial, que han sido amplificadas mediante PCR, siendo a veces clonadas, previamente a su secuenciación. Estos marcadores moleculares son fragmentos de los genes mitocondriales citocromo oxidasa subunidad I y ADN ribosomal 16S; fragmentos de los genes nucleares adenina nucleótido translocasa y ADN ribosomal 18S; y la región nuclear que contiene los espaciadores ribosomales ITS1 e ITS2, y el gen ribosomal 5.8S. Algunos de ellos se han empleado solo a nivel poblacional, algunos solo a nivel de especie, mientras que otros se han empleado a ambos niveles. En el capítulo 4.1.1 se estudió el ligamiento entre el ADN ribosomal 5S y el ADN nuclear pequeño U1. Se describieron unidades de ligamiento entre ambas familias multigénicas en 10 especies (de cuatro géneros diferentes) de la familia Pharidae. Se obtuvo un número de clones que contenían repeticiones parciales o completas de ambos genes, en las que las regiones codificantes mostraron la misma orientación. Se obtuvo una completa colección de clones de ADN ribosomal 5S de varias especies de navajas, tanto ligados como no ligados al ADN nuclear pequeño U1. También se predijo la estructura secundaria de las regiones codificantes, y se caracterizó los elementos conservados de las regiones aguas arriba y aguas abajo de las mismas. El análisis de los espaciadores no transcritos (NTS) del ADN ribosomal 5S mostró que algunos de ellos estaban evolutivamente más relacionados con NTS de otras especies que con aquellos de la misma, sugiriendo polimorfismo ancestral y evolución a largo plazo mediante el proceso de birth-and-death. La conservación nucleotídica dentro de las regiones funcionales sugirió que la selección purificadora, además de los entrecruzamientos desiguales y las conversiones génicas, estuvieron implicados en la evolución de estas familias multigénicas. Considerando este estudio y otros previos, se discutieron los posibles mecanismos mediante los cuales ambas familias multigénicas han podido establecerse en unidades de ligamiento en el linaje de los Pharidae. La razón por la que el ADN ribosomal 5S se encuentra a menudo ligado a otras familias multigénicas parece ser el resultado de procesos estocásticos dentro de los genomas en el que su alto número de copia sería determinante. En el capítulo 4.1.2 se amplió el estudio anterior a 97 especies de metazoos, cuyos genomas estaban secuenciados y disponibles en bases de datos internacionales. Se analizaron y compararon sistemáticamente secuencias de ADN ribosomal 5S en especies de los principales clados de metazoos, usando métodos bioinformáticos. Tras haber realizado un filtrado de las secuencias candidatas, se obtuvieron 12766 copias putativamente funcionales que nos permitieron identificar algunas características generales del ADN ribosomal 5S de los animales. También se muestra que cada especie de mamífero analizada tiene una copia altamente conservada de ADN ribosomal 5S (que denominamos housekeeping) así como muchas otras copias más variables. Se analizó en detalle los NTS, la organización de esta familia multigénica en el genoma y su evolución. Nuestros resultados confirmaron la existencia de copias parálogas en 58 genomas. También fue evidente una organización flexible dentro del genoma de los animales. La existencia de agrupaciones heterogéneas de copias de ADN ribosomal 5S (compuestas de regiones codificantes similares y de NTS divergentes) en muchas especies apoya la hipótesis de un intercambio de ADN ribosomal 5S de un locus a otro del genoma. Además, obtuvimos un análisis detallado del grado de conservación evolutiva de las regiones promotoras internas, aguas arriba y aguas abajo en animales. Por último, describimos un método estadístico para analizar el ligamiento entre familias multigénicas codificadoras de ARN, que sin embargo no obtuvo ningún resultado de ligamiento estable entre el ADN ribosomal 5S y otras familias a lo largo de la evolución de los metazoos. En el siguiente capítulo (4.2) se realizó un estudio citogenético de la navaja europea Ensis minor (Chenu, 1843) y de la americana E. directus (Conrad, 1843). Se vio que ambas tienen un número cromosómico diploide de 38 y notables diferencias cariotípicas. E. minor tiene cuatro pares de cromosomas metacéntricos, uno metacéntrico-submetacéntrico, cinco submetacéntricos, uno subtelocéntrico y ocho telocéntricos. En cambio E. directus tiene tres pares metacéntricos, dos metacéntricos-submetacéntricos, seis submetacéntricos, seis subtelocéntricos y dos telocéntricos. La hibridación in situ fluorescente usando una sonda de genes ribosomales mayores localizó estos genes en un par submetacéntrico en ambas especies. La hibridación con ADN ribosomal 5S produjo una señal cromosómica débil en E. minor y ninguna en E. directus, apoyando una organización más dispersa de esta familia multigénica, comparada con la de los genes ribosomales mayores. La sonda telomérica de vertebrados (TTAGGG)n hibridó en ambos telómeros de cada cromosoma, sin señales intersticiales. Además, en este trabajo se realizó un estudio cariológico comparado de las cuatro Ensis analizadas hasta la fecha, las europeas E. minor, E. siliqua (Linné, 1758) y E. magnus Schumacher, 1817, y la americana E. directus. Las especies europeas mostraron más similitudes entre ellas que con E. directus. Además, se encontraron diferencias cariotípicas claras entre las especies morfológicamente similares E. minor y E. siliqua, en el número de pares cromosómicos telocéntricos y subtelocéntricos. En el capítulo 4.3 obtuvimos los niveles de variación genética actual de poblaciones de la navaja E. directus (Mollusca: Bivalvia: Pharidae) en los rangos de distribución nativo (América del Norte) e introducido (Europa) usando secuencias nucleares y mitocondriales. Esperábamos menor variación en el rango de distribución introducido, sobre todo considerando los frecuentes episodios de mortalidad en masa observados en Europa desde la introducción de la especie en 1978. Sin embargo, encontramos mayor variación en Europa. En este trabajo los resultados se comentaron a la luz de la posible influencia de incrementos o reducciones temporales de la variación genética, del efecto limitado de la deriva genética aleatoria y de posibles introducciones múltiples. Curiosamente, la hipótesis de las introducciones múltiples contrasta con la colonización gradual de la costa europea por parte de E. directus, pero es apoyada por la intensidad del tráfico transoceánico en el Atlántico. Por último, evidencias genéticas y morfométricas apoyaron claramente que los individuos de una población analizada de Terranova (Canadá) pertenecían a una especie nueva, desconocida hasta la fecha. Esta nueva Ensis se describió formalmente en este capítulo y fue denominada E. terranovensis n.sp. En el último capítulo (4.4) se realizó un trabajo de delimitación de especies y DNA barcoding en las Ensis del Atlántico, en el que se estudió si las morfoespecies actualmente descritas eran linajes evolutivos diferentes. En este trabajo estudiamos 109 especímenes pertenecientes a nueve especies de Ensis (todas las especies actuales del Atlántico) y en ellas analizamos la variación nucleotídica en cuatro regiones nucleares y en dos regiones mitocondriales. Los análisis filogenéticos realizados apoyan la monofilia recíproca de estas especies a cada lado del océano Atlántico. En Europa se encontraron cuatro linajes claramente diferenciados, que se correspondieron con las especies E. magnus, E. ensis (Linné, 1758), E. minor y E. siliqua, demostrándose, además, que E. minor y E. siliqua conviven en la costa NO de la Península Ibérica. Un grado de divergencia bastante relevante se apreció entre individuos de E. macha (Molina, 1792) muestreados en Chile y en Argentina, lo cual sugiere especiación incipiente. Además, se confirmó la presencia de E. directus al norte de Florida. De entre las regiones genómicas analizadas, se sugiere el fragmento de la citocromo oxidasa subunidad I para ser utilizada en identificación mediante DNA barcoding. Las contribuciones más relevantes de esta tesis son las siguientes: Se demostró que existen copias de ADN ribosomal 5S ligadas a copias de ADN pequeño nuclear U1 en los genomas de al menos 10 especies de la familia Pharidae, de cuatro géneros diferentes. Además de caracterizar, a nivel nucleotídico, ambas familias multigénicas, las secuencias obtenidas del ADN pequeño nuclear U1 son las primeras en la Clase Bivalvia. Se caracterizó por vez primera la diversidad del ADN ribosomal 5S en una escala evolutiva amplia, es decir, en 97 especies de metazoos. Se caracterizaron las especies E. minor y E. directus a nivel citogenético, obteniéndose conclusiones aplicadas a la taxonomía de estas especies, y a la organización genómica del ADN ribosomal 5S y de los genes ribosomales mayores. Se estudió la variación genética de poblaciones de E. directus en los rangos de distribución nativo e introducido, y se descrubrió y describió una nueva especie en Terranova, Canadá a la que se le llamó E. terranovensis. Se clarificó el estatus taxonómico de las especies actuales de Ensis en el Atlántico, y se definió que la región COI es adecuada para la identificación de estas especies mediante DNA barcoding